引言 Introduction

　　抗体偶联药物（ADC）是一类将抗体和细胞毒性的小分子药物通过连接子偶联而成的生物药。在其偶联反应过程中，反应时长和底物当量等因素会直接影响关键质量属性DAR值。过程分析技术（PAT）为实时追踪ADC的生物偶联过程提供了解决方案。近期，赛分科技的合作伙伴默克发表相关文章“Process Analytical Technology for Real-Time Monitoring of Pharmaceutical Bioconjugation Reactions”，阐述了一种利用疏水相互作用色谱（HIC）技术实时监测ADC偶联反应的创新方法，文献中采用高疏水性色谱柱Proteomix HIC Phenyl-NP5，实现对裸抗和不同DAR值样品的高效分离，为ADC药物的研发提供了更精确、高效的监测手段。

背景介绍

　　随着生物医药产业的蓬勃发展，过程分析技术（PAT）已成为监测药物生产过程的重要措施，通过对生产过程中的关键参数进行实时监控和分析，及时发现并纠正潜在问题，从而确保最终产品的质量和安全性。近年来，多种分析技术已被应用于ADC药物DAR值的分析与表征，其中，HIC法以分辨率高、色谱条件温和等特点脱颖而出，它的作用机理主要是利用ADC药物与未偶联抗体在疏水性上的差异进行分离，疏水性低的未偶联抗体首先被洗脱，偶联小分子后的ADC疏水性增加，洗脱时间延迟。且HIC法能够精确地捕捉到载药量的细微差异，故通常作为检测ADC药物分布、裸抗含量及平均DAR值的标准方法。

文章概述

　　文献中ADC药物的生物偶联反应（Bioconjugation Reaction）选择极性非质子溶剂DMSO（二甲亚砜），可有效溶解疏水性较强的小分子药物及部分亲水性成分，提供了一个理想的偶联反应体系。当还原后的单克隆抗体（mAb）进入该体系时，原本由二硫键连接的游离半胱氨酸残基得以释放，与马来酰亚胺连接子的活性基团发生特异性反应，形成了稳定的硫酯键。研究中探索了一种偶联反应的HIC-HPLC监测方法，结合PAT技术对实验参数进行精准调节，并采用Proteomix HIC Phenyl-NP5色谱柱进行分析，该色谱柱固定相为苯基键合聚苯乙烯/二乙烯基苯（PS/DVB），具有高疏水性，准确监测反应过程中DAR值变化，从而实现控制终产物反应至理想状态的目标。

　　实验方案

　　Column: Proteomix HIC Phenyl-NP5（5μm, 4.6x100 mm）

　　Sample: Small Molecule Conjugation

　　Mobile Phase: 

　　A:3M ammonium acetate, 50mM potassium phosphate, 5% acetonitrile, pH 7.0

　　B: 5% acetonitrile

　　Flow Rate: 0.25 mL/min

　　Temperature: 30°C

　　Detection: UV at 280 nm

　　Amount: 50 μg

图1.偶联过程中形成的三种DAR组分的疏水相互作用色谱（HIC）分离

　　图1代表偶联反应中mAb与不同当量LP（Linker-Payload）生成的3种DAR产物经Proteomix HIC Phenyl-NP5的分离效果。A对应mAb与不同当量的LP反应生成的产物，图B、C、D色谱图分别对应低、中、高当量LP的反应结果，色谱图中黄色、蓝色和紫色星星分别对应 DAR0、DAR1和 DAR2。根据各当量的平均DRA值，可以得出要想达到目标DAR值2.0，必须采用高当量LP进行偶联反应。

实验结论

　　综上所述，Proteomix HIC Phenyl-NP5分析方法不仅能有效监测ADC药物偶联反应过程，还可评估不同当量LP的反应效果，有助于优化ADC药物的生物偶联反应条件，以达到期望的目标DAR值，同时可降低下游纯化难度，这对于ADC药物合成工艺重要的意义。

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