单抗药物分析解决方案
单克隆抗体（Monoclonal Antibody，mAb，中文简称单抗）药物作为生物大分子治疗领域的核心产品，至今仍在全球医药市场占据重要地位。截至目前，国内已有超过100个抗体药物获批上市，广泛应用于肿瘤、自身免疫性疾病、血液系统疾病、皮肤病等领域。随着抗体药物作用机制的持续突破和应用范围的快速拓展，新品种上市数量显著增加，推动整体市场规模迅猛扩张。为确保单抗药物质量可控性与安全性，本文对单抗样品分析中常用的HPLC方法及相关色谱柱产品进行整理，旨在为方法开发与色谱柱筛选提供清晰、实用的参考指南。
本文内容涵盖色谱柱选择指南、应用案例、产品使用指南、文献分析方法推荐等，欢迎查阅!
单抗色谱柱选择指南
纯度与杂质|体积排阻色谱
案例1. SRT SEC-300 Excel色谱柱分析系统适用性样品分子大小变异体（3127通则）
Column: SRT SEC-300 Excel （5 μm, 300 Å, 7.8×300 mm）
Mobile phase: 50 mM PB+250 mM KCl, pH 6.2
Flow rate: 0.5 mL/min
Detector: UV 280 nm
Column temperature: 25 ℃
Sample temperature: 2-8 ℃
Injection volume: 20 μL
Run time: 30 min
Sample: SST （10 mg/mL）
图1. 不同品牌色谱柱分析系统适用性样品对比图谱
SRT SEC-300 Excel 色谱柱满足2025年版《中国药典》3127通则新增的体积排阻色谱法对系统适用性测试（SST）的要求，其分析性能与竞品相当，可作为单抗药物分子大小变异体分析的可靠选择。
案例2. SRT SEC-300 Excel色谱柱分析阿达木单抗样品分子大小变异体（2025年版中国药典方法）
Column: SRT SEC-300 Excel （5 µm, 300 Å, 7.8×300 mm）
Mobile phase: 50 mM PB+250 mM KCl, pH 6.2
Flow rate: 0.5 mL/min
Detector: UV 280 nm
Column temperature: 25 °C
Injection volume: 20 µL
Sample: Adalimumab （1 mg/mL）
图2. SRT SEC-300 Excel分析阿达木单抗样品图谱
案例3. SRT-C SEC-300色谱柱分析利妥昔单抗样品分子大小变异体（2025年版中国药典方法）
Column: SRT-C SEC-300 （5 µm, 300 Å, 7.8×300 mm）
Mobile phase: 50 mM PB+250 mM KCl, pH 6.2
Flow rate: 0.5 mL/min
Detector: UV 280 nm
Column temperature: 25 °C
Injection volume: 100 µL
Sample: Rituximab （1 mg/mL）
图3. SRT SEC-300分析利妥昔单抗样品图谱
案例4. Zenix-C SEC-300色谱柱分析单抗样品
Column: Zenix-C SEC-300 （3 µm, 300 Å, 7.8×300 mm）
Zenix SEC-300 （3 µm, 300 Å, 7.8×300 mm）
Mobile phase: 150 mM PB, pH 7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Detector: UV 280 nm
Column temperature: 25 °C
Injection volume: 10 µL
Sample: mAb （1.23 mg/mL）
图4. 不同类型色谱柱分析单抗样品对比图谱
案例5. Unix-C SEC-300色谱柱分析单抗Vectibix样品
Column: Unix-C SEC-300 （1.8 µm, 4.6×300 mm）
Zenix-C SEC-300 （3 μm, 7.8×300 mm）
Mobile phase: 150 mM PB, pH 7.0
Flow rate: 0.3 mL/min
Detector: UV 280 nm
Column temperature: 25 ℃
Injection volume: 1.5 µL
Sample: Vectibix （20 mg/mL）
图5. 3 μm与1.8 μm分析单抗样品对比图谱
以上三个案例分别采用不同粒径体积排阻色谱柱对不同单抗样品进行分析，常规分离采用5 μm粒径色谱柱SRT SEC-300 Excel，该款色谱柱经测试满足2025版《中国药典》单抗测试要求，在阿达木、利妥昔、曲妥珠等几款单抗测试均符合要求。
分析难度较高可采用3 μm粒径Zenix-C SEC-300进行样品检测。为适应快速分析和分离更高难度样品可采用1.8 μm粒径Unix-C SEC-300，适配UPLC系统。
电荷异质体 | 离子交换色谱
案例6. Antibodix WCX色谱柱分析单抗样品
Column: Antibodix WCX-NP5P （5 µm, 4.6×250 mm）
Mobile phase A: 10 mM PB, pH 7.0
B: A+100 mM NaCl, pH 7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Detector: UV 280 nm
Column temperature: 45 ℃
Injection volume: 50 µL
图6. Antibodix WCX分析单抗样品图谱
图7. Antibodix WCX不同批次分析单抗样品对比图谱
案例7. Proteomix SCX色谱柱分析单抗样品
Column: Proteomix SCX-NP5P （5 µm, 4.6×250 mm）
Vendor SCX
Mobile phase: A: 10 mM PB, pH 7.0
B: A+0.5 M NaCl
Flow rate: Vendor SCX: 0.75 mL/min
Proteomix SCX: 1.0 mL/min
Detector: UV 280 nm
Column temperature: 25 ℃
Samples: 10 mg/mL mAb
图8. Proteomix SCX分析单抗样品体图谱
电荷变异体分析常用cIEF或icIEF的方式和离子交换色谱法。常规样品采用离子交换即可有效分析样品，方法成熟，还可进行样品制备，也是目前常用的分析方法之一。对于单抗样品，通常样品等电点大于7，一般采用强阳离子交换或者弱阳离子交换色谱柱进行分析。以上两个案例涉及Proteomix SCX强阳离子交换和Antibodix WCX弱阳离子交换，两个系列产品包含不同粒径规格，可满足分析到制备的不同需求。
单抗含量 | 亲和色谱
案例8. ProAqa Excel色谱柱分析单抗含量
Column: ProAqa Excel （2.1×30 mm, SS）
Mobile phase: A: 50 mM PB+150 mM NaCl, pH 7.0
B: 100 mM glycine, pH 2.5
Column temperature: 25 °C
Flow rate: 1 mL/min
Detctor: UV 280 nm
Injection volume: 10 µL
Sample: 3.75 mg/mL hIgG溶液
图9. ProAqa Excel分析单抗样品图谱
图10. ProAqa Excel线性范围测试
单抗含量测定通常用于样品表达量的初步测试，色谱柱ProAqa Excel为Protein A亲和色谱柱，可于2 min快速分析单抗表达量，含量线性范围覆盖0.029 mg/mL-7.5 mg/mL。色谱柱使用寿命长，Life Cycle可达2000针以上。
氧化杂质 | 疏水分析
案例9. Proteomix HIC-Butyl色谱柱分析抗体氧化杂质
Column: Proteomix HIC Butyl-NP5 （5 μm, 4.6×250 mm）
Mobile phase: A: 2 M sodium sulfate in tris-base，pH 7.0
B: tris-base at pH 7.0
Flow rate: 0.5 mL/min
Column temperature: 30 °C
Detection: UV 280 nm
Injection volume: 30 μg
图11. Proteomix HIC Butyl分析单抗样品氧化杂质图谱[1]
样品制备
案例10. 离子交换色谱制备单抗样品
Column: Antibodix WCX-NP10 （10 µm, 21.2×250 mm）
Mobile phase: A: 10 mM PB, pH 6.8
B: A+100 mM NaCl, pH 6.8
Flow rate: 10.0 mL/min
Detector: UV 280/214 nm
Column temperature: RT
Injection volume: 50 µL
Sample: mAb （19.3 mg/mL）
图12. 离子交换色谱制备单抗样品及分段收集纯度分析
案例11. 体积排阻色谱制备单抗样品
Column: SRT-10C SEC-300 （10 µm, 300 Å, 21.2×300 mm）
Mobile phase: 150 mM PB, pH 7.0
Flow rate: 7 mL/min
Detector: UV 280 nm
Sample: BSA （10 mg/mL）
图13. BSA在SRT-10C SEC-300制备柱载量测试
经测试体积排阻色谱可有效快速制备高纯度单抗样品，下表将不同规格分析柱及制备柱的上样量进行总结，以供方法开发进行参考。
表1. SRT-10/10C SEC色谱柱上样量参考
产品信息
产品使用指南
该内容介绍单抗样品质量控制涉及的液相色谱柱产品的活化、清洗、流动相配置等，信息将持续更新。
单抗文献分析方法推荐
该内容收录单抗样品相关文献分析方案介绍，内容也将持续更新，欢迎查看。
[1] Zhuoyu Liu, Yanjing Cao, Lei Zhang, Ya Xu, and Zhongli Zhang. In-Depth Characterization of mAb Charge Variants by On-Line Multidimensional Liquid Chromatography-Mass Spectrometry[J]. ACS Pharmacology & Translational Science, DOI: 10.1021/acsptsci.4c00296.
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