双抗及多抗药物分析解决方案
双特异性抗体(Bispecific antibody，BsAb，下文简称双抗)是一种能够同时特异性结合两个不同抗原或表位的抗体药物，其作用机制包括介细胞桥联作用、桥联受体作用、介导蛋白复合物形成等。双抗结构主要分为是否含Fc区，是否对称等，结构更加多变(见图1)。而多特异性抗体(简称多抗)是能同时结合三个以上的抗原或表位的抗体。与单抗相比，双抗及多抗结构更复杂且具有多样性，质量控制难度进一步提升。为助力双抗及多抗药物的研发与质量控制，对双抗及多抗样品分析中常用的HPLC方法及相关色谱柱产品进行整理，旨在为方法开发与色谱柱筛选提供清晰、实用的参考指南。
本文内容涵盖色谱柱选择指南、应用案例、产品使用指南、文献分析方法推荐等，欢迎查阅!
图1. 双抗药物不同结构示意图[1]
双抗及多抗色谱柱选择指南
分子大小变异体 | 体积排阻色谱
案例1. SRT-C SEC-300色谱柱分析双抗样品
Column: SRT-C SEC-300 (5 µm, 300 Å, 7.8×300 mm)
Mobile phase: 150 mM PB, pH 7.0+10% IPA
Flow rate: 0.8 mL/min
Detector: UV 280 nm
Column temperature: 25 °C
Injection volume: 15 µL
Sample: BsAb (2.0 mg/mL)
图2. SRT-C SEC-300分析双抗样品图谱
案例2. SRT-C SEC-300色谱柱分析双抗样品
Column: SRT-C SEC-300 (5 µm, 300 Å, 7.8×300 mm)
Vendor SEC
Mobile phase: 50 mM PB+250 mM KCl, pH 7.0
Flow rate: 0.5 mL/min
Detector: UV 280 nm
Column temperature: 25 °C
Injection volume: 25 µL
Sample: BsAb
图3. 不同品牌色谱柱分析双抗样品对比图谱
案例3. SRT SEC-300 Excel色谱柱分析双抗样品
Column: SRT SEC-300 Excel (5 µm, 300 Å, 7.8×300 mm)
Mobile phase: 50 mM PB+300 mM NaCl, pH 6.5
Flow rate: 1.0 mL/min
Detector: UV 280 nm
Column temperature: 25 °C
Injection volume: 100 µg
Sample: BsAb
图4. SRT SEC-300 Excel分析双抗样品图谱
案例4. Unix-C SEC-300色谱柱分析双抗样品
Column: Unix-C SEC 300 (1.8 µm, 300 Å, 4.6×300 mm)
Mobile phase: 50 mM PB+400 mM Arginine, pH 7.0+10% IPA
Flow rate: 0.25 mL/min
Detector: UV 280 nm
Column temperature: 25 ℃
Injection volume: 10 µL
Sample: BsAb (1.0 mg/mL)
图5. Unix-C SEC 300分析双抗样品图谱
案例5. SRT-C SEC-300色谱柱分析三抗样品
Column: SRT-C SEC-300 (5 µm, 300 Å, 7.8×300 mm)
Mobile phase: 50 mM PB+400 mM Arginine, pH 6.5+10% IPA
Flow rate: 0.5 mL/min
Detector: UV 280 nm
Column temperature: 25 ℃
Injection volume: 40 µL
Sample: 三抗 (0.53 mg/mL)
图6. SRT-C SEC-300分析三抗样品图谱
SRT/Unix-C SEC-300均采用“Lay-down”表面修饰，降低非特异性吸附。SRT SEC-300 Excel对于柱效和拖尾表现进一步提升，不同规格体积排阻色谱柱满足双抗或多抗(如三抗)样品分子大小变异体分析不同需求，精准分离其聚体与片段。
双抗错配体 | 体积排阻色谱
案例6. BioMix SEC色谱柱分析双抗错配体
Column: BioMix SEC (3 µm, 300 Å, 7.8×300 mm)
Zenix-C SEC 300 (3 µm, 300 Å, 7.8×300 mm)
Mobile phase: PBS+600 mM NaCl, pH 7.4
Flow rate: 0.5 mL/min
Detector: UV 280 nm
Column temperature: 25 °C
Injection volume: 4 µL
Sample: BsAb (14.0 mg/mL)
图7. 不同分离模式色谱柱分析双抗样品对比图谱
双抗在生产过程中，轻链与重链的错配是影响纯度和药效的关键因素之一。采用 BioMix SEC能够高效分离双抗样品中的错配体(如重链同源二聚体、半抗体、轻链错配体)，有助于细胞培养筛选、工艺开发和药物纯度评价。
电荷异质体 | 离子交换色谱
案例7. Proteomix SCX色谱柱分析双抗样品
Column: Proteomix SCX-NP5P (5 µm, 4.6×250 mm)
Mobile phase: A: 40 mM NaH2PO4
B: 40 mM Na2HPO4
Flow rate: 0.5 mL/min
Detector: UV 280 nm
Column temperature: 25 ℃
Injection volume: 3 µL
Sample: BsAb (3.0 mg/mL)
图8. Proteomix SCX分析双抗样品图谱
案例8. Antibodix WCX色谱柱分析双抗样品
Column: Antibodix WCX-NP10P (10 µm, 4.6×250 mm)
Mobile phase: A: 20 mM MES, pH 6.5
B: 20 mM MES+0.5 M NaCl, pH 6.5
Flow rate: 0.5 mL/min
Detector: UV 280 nm
Column temperature: 25 ℃
Injection volume: 3 µL
Sample: BsAb
图9. Antibodix WCX分析双抗样品图谱
双抗末端修饰、糖基化等关键因素会改变表面电荷，进而影响药物的组织分布与药代动力学特性。采用 Proteomix SCX或Antibodix WCX可实现酸碱峰分离，为双抗样品的电荷异质性监控与分析提供可靠技术支撑。
杂质 | 疏水作用色谱
案例9. Proteomix HIC Butyl色谱柱分析双抗硫酸氧化变体
Column: Proteomix HIC Butyl-NP5 (5 μm, 4.6×100 mm)
Vendor Butyl-NPR (2.5 μm, 4.6×100 mm)
Mobile phase: A: 80 mM 磷酸钠+2M 硫酸铵, pH 7.0
B: 100 mM 磷酸钠, pH 7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Detector: UV 220 nm
Column temperature: 25 ℃
Injection volume: 5 µL
Sample: BsAb
图10. 不同品牌色谱柱分析磺化双抗对比图谱[2]
(sY1-单硫酸化峰, sY2-双硫酸化峰, sY0-未硫酸化的峰)
案例10. Proteomix HIC Butyl色谱柱分析双抗样品杂质
Column: Proteomix HIC Butyl-NP5 (5 μm, 4.6×250 mm)
Mobile phase: A: 50 mM PB+1.0 M Na2SO4, pH 6.5
B: 50 mM PB, pH 6.5
C: IPA
Flow rate: 0.6 mL/min
Detector: UV 280 nm
Column temperature: 30 ℃
Injection volume: 5 µL
Sample: BsAb (10.0 mg/mL)
图11. Proteomix HIC Butyl分析双抗样品图谱
Proteomix HIC Butyl色谱柱具有中等疏水性，应用广泛，通过盐浓度梯度变化分离不同疏水性组分。用于双抗硫酸化变体分析、疏水蛋白杂质分析。同时还可采用疏水分析方式分离双抗错配组分。赛分科技1.7 μm小粒径苯基(Phenyl)疏水柱，可更高效快速分析疏水差异样品。
订购信息
*如需了解更多产品信息欢迎联系我们
产品使用指南
该内容介绍双抗及多抗样品分析涉及的液相色谱柱产品的活化、清洗、流动相配置等，信息将持续更新。
双抗及多抗文献分析方法推荐
该内容收录多抗及多抗样品相关文献分析方案介绍，内容也将持续更新，欢迎查看。
[1]Herrera M, et.al. Bispecific antibodies: advancing precision oncology [J]. Trends in cancer. 2024, 10(10):893-919.DOI:10.1016/j.trecan. 2024.07.002.
[2]Hao Luo, et al. Structure-function relationship study for sulfated protein therapeutics using hydrophobic interaction chromatography and mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2024, 1233: 123981.
联系我们
公司网址：https://www.sepax-tech.com.cn
色谱柱垂询：18913107255(微信同号)
色谱柱试用申请：扫描下方二维码
上一篇ADC药物分析解决方案
下一篇单抗药物分析解决方案
