抗体偶联药物(ADC)凭借“靶向抗体-连接子-细胞毒性载荷”的偶联结构(见图1)，为肿瘤等恶性疾病提供了新的治疗突破。然而，这种偶联特性也带来了比传统单抗更为复杂的结构异质性，对分析表征和质量控制提出了更高要求。为助力ADC样品关键质量属性(CQAs)的精准评估，现对ADC样品分析中常用的HPLC方法及相关色谱柱产品进行整理，旨在为方法开发与色谱柱筛选提供清晰、实用的参考指南。

本文内容涵盖色谱柱选择指南、应用案例、产品使用指南、文献分析方法推荐等，欢迎查阅!

图1. ADC药物结构示意图

ADC色谱柱选择指南

分子大小变异体 | 体积排阻色谱

案例1. Zenix-C SEC-300色谱柱分析ADC样品

Column: Zenix-C SEC-300 (3 µm, 300 Å, 7.8×300 mm)

Vendor SEC (5 µm, 250 Å, 7.8×300 mm)

Mobile phase: 150 mM PB, pH 7.0

Flow rate: 1.0 mL/min

Detector: UV 280 nm

Column temperature: 25 °C

Injection volume: 10 µL

Sample: Herceptin-lysine drug conjugate(2.05 mg/mL)

图2. 不同品牌色谱柱分析ADC样品对比图谱

案例2. SRT SEC-300 Excel色谱柱分析ADC样品

Column: SRT SEC-300 Excel (5 µm, 300 Å, 7.8×300 mm)

Mobile phase: 50 mM PB+400 mM Arginine, pH 6.5+15% IPA

Flow rate: 0.5 mL/min

Detector: UV 280 nm

Column temperature: 25 °C

Injection volume: 5 µL

Sample: ADC

图3. SRT SEC-300 Excel分析ADC样品图谱

案例3. SRT-C SEC-300色谱柱分析ADC样品

Column: SRT-C SEC-300 (5 µm, 300 Å, 7.8×300 mm)

Mobile phase: 50 mM PB+250 mM KCl+10% IPA, pH 7.0

Flow rate: 0.5 mL/min

Detector: UV 280 nm

Column temperature: 25 °C

Injection volume: 20 µL

Sample: ADC

图4. SRT-C SEC-300分析ADC样品图谱

ADC药物制备过程中可能产生聚集体，裸抗通过Linker与小分子化合物偶联，其疏水性增强，可采用非特异性吸附更低的Zenix-C SEC-300/SRT SEC-300 Excel色谱柱进行聚集体分析，可有效检测ADC药物聚集体、片段。

电荷异质体 | 离子交换色谱

案例4. Proteomix SCX色谱柱分析ADC样品

Column: Proteomix SCX-NP5P (5 µm, 4.6×250 mm)

Mobile phase: A: 20 mM MES, pH 6.5

                       B: 20 mM MES+0.15 M NaCl, pH 6.5

                       C: IPA

Flow rate: 0.8 mL/min

Detector: UV 280nm

Column temperature: 25 ℃

Injection volume: 30 µL

Sample: ADC (1 mg/mL)

图5. Proteomix SCX分析ADC样品图谱

案例5. Antibodix WCX色谱柱分析ADC样品

Column: Antibodix WCX-NP10P (10 µm, 4.6×250 mm)

Mobile phase: A: 20 mM MES, pH 6.3

                       B: 20 mM MES+0.5 M NaCl, pH 6.3

Flow rate: 0.5 mL/min

Detector: UV 280 nm

Column temperature: 25 ℃

Injection volume: 25 µL

Sample: ADC

图6. Antibodix WCX分析ADC样品图谱

案例6. Antibodix WCX制备/分析ADC样品

Column: Antibodix WCX-NP5P (5 µm, 4.6×250 mm)

                       Antibodix WCX-NP5 (5 µm, 10.0×250 mm)

Mobile phase: A: 20 mM MES, pH 6.5

                       B: 20 mM MES+0.25 M NaCl, pH 6.5

Flow rate: 0.5/2.36 mL/min

Detector: UV 280 nm

Column temperature: 25 ℃

Injection volume: 25 µL/100 μL

Sample: ADC

图7. Antibodix WCX分析柱与制备柱分析ADC样品对比图谱

ADC药物分子结构复杂，其制备过程中易形成电荷分布高度异质的产物，产生酸性或碱性组分，影响药物疗效。采用ProteomixSCX/Antibodix WCX色谱柱可实现对酸性、碱性组分的有效分离与监测，为ADC药物的电荷异质性分析提供可靠手段。

DAR与载药分布 | 疏水作用色谱

案例7. Proteomix HIC Butyl色谱柱DAR值分析

Column: Proteomix HIC Butyl-NP5 (5 μm, 4.6×35 mm)                       

                       Vendor-Butyl (2.5 μm, 4.6×35 mm)

Mobile phase: A: 25 mM PB+2.0 M (NH4)2SO4, pH 7.0

                       B: 25 mM PB, pH7.0

                       C: IPA

Flow rate: 0.3 mL/min

Detector: UV 280 nm

Column temperature: 25 ℃

Injection volume: 10 µL

Sample: ADC (5 mg/mL)

图8. 不同品牌Butyl色谱柱分析ADC样品对比图谱

案例8. Proteomix HIC Butyl制备/分析ADC样品

Column：Proteomix HIC Butyl-NP5 (5 μm, 4.6×35 mm)

Proteomix HIC Butyl-NP5 (5 μm, 10×250 mm)

Flow rate: 0.6/2.5 mL/min

Injection volume: 10 µL/50 μL

Sample: ADC

图9. Proteomix HIC Butyl制备柱分析ADC样品图谱

案例9. Proteomix HIC Phenyl色谱柱DAR值分析

Column: Proteomix HIC Phenyl-NP5 (5 μm, 4.6×100 mm)

Mobile phase: A: 25 mM PB+2.0 M Na2SO4, pH 6.5

                       B: 25 mM PB, pH 6.5

                       C: IPA

Flow rate: 0.6 mL/min

Detector: UV 280 nm

Column temperature: 25 ℃

Injection volume: 20 µL

Sample: ADC (1 mg/mL)

图10. Proteomix HIC Phenyl分析ADC样品图谱

ADC样品因小分子药物的引入，会显著增加疏水性，该特性与药物的偶联数量(DAR)直接相关，采用Proteomix HIC Butyl/Phenyl色谱柱可有效实现不同DAR组分的分离与定量，并计算平均DAR值。HIC系列色谱柱粒径还有1.7 μm、5 μm，可适配UPLC、HPLC以及半制备不同系统，以上案例展示HIC色谱柱用于高分辨样品分析和快速制备。

杂质 | 反相作用色谱

案例10. Proteomix RP色谱柱分析半胱氨酸ADC样品

Column: Proteomix RP-1000 (5 µm, 1000 Å, 4.6×100 mm)

Mobile phase: A: 0.1% TFA in H2O

B: 0.1% TFA in 100% ACN

Flow rate: 1.0 mL/min

Detector: UV 210 nm

Column temperature: 80 ℃

Injection volume: 10 µL

Sample: Herceptin and ADCs (1 mg/mL)

图11. Proteomix RP-1000分析ADC样品图谱

案例11. Proteomix RP色谱柱分析ADC样品

Column: Proteomix RP-1000 (5 µm, 1000 Å, 2.1×50 mm)

Mobile phase: A: 0.1% TFA in H2O

B: 0.1% TFA in 100% ACN

Flow rate: 0.6 mL/min

Detector: UV 210 nm

Column temperature: 80 ℃

Injection volume: 1 μL

Sample: mAb/ADC1/ ADC2

图12. Proteomix RP-1000短柱快速分析ADC样品图谱

案例12. Proteomix RP色谱柱分析ADC样品

Column: Proteomix RP-1000 (5 µm, 1000 Å, 2.1×50 mm)

Mobile phase: A: 2%乙腈水溶液含0.1% TFA

                       B: 乙腈含0.1% TFA

Flow rate: 0.5 mL/min

Detector: UV 280 nm

Column temperature: 80 ℃

Injection volume: 20 µL

Sample: ADC

图13. Proteomix RP-1000分析ADC样品图谱[1]

Proteomix RP-1000反相色谱柱基质为单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯微球，粒径为5 μm，孔径1000 Å，适用于生物大分子样品的高分辨率分析，能够高效分离ADC样品，且短柱可实现快速分析。

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产品使用指南

该内容介绍ADC样品分析涉及的液相色谱柱产品的活化、清洗、流动相配置等，信息将持续更新。

ADC文献分析方法推荐

该内容收录ADC样品相关文献分析方案介绍，内容也将持续更新，欢迎查看。

[1]Matsuda Y, Leung M, Tawfiq Z, Fujii T, Mendelsohn BA. In-situ Reverse Phased HPLC Analysis of Intact Antibody-Drug Conjugates[J]. Analytical Sciences, 2021, Advance Publication. DOI: 10.2116/analsci.20P424.

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